Tip:
Highlight text to annotate it
X
ציטומטריה של זרימה - FACS
ציטומטריה היא שיטה חשובה
לניתוח פרמטרים רבים של תאים יחידים
באוכלוסיות לא אחידות
ציטומטרים משמשים במגוון רחב של יישומים
כמו אפיון עם נוגדנים, אפיון גנומי
ספירת תאים וניתוח ביטוי חלבונים פלורסנטים
הציטומטר מבצע את האנליזה
על ידי העברת אלפי תאים לשניה דרך אלומת לייזר
וקליטת האור היוצא מכל תא כאשר הוא עובר דרכו
המידע שנאסף יכול להשמר כמידע סטטיסטי
בעזרת תוכנות מתאימות המדווחות על מאפיינים תאיים
כמו גודל, מורכבות, פנוטיפ ובריאות
בסרטון זה נראה כיצד ציטומטר פועל
כיצד פיזור אור ופלורסנציה נקלטים בציטומטר
וכיצד המידע המתקבל מנותח
תצוגה זו מראה את המערכות העיקריות של הציטומטרים
:אלו הם
מערכת הנוזלים, אשר מוליכה את הדגימות לנקודת הבדיקה ומפנה את הפסולת
הלייזרים, אשר מהווים את מקור האור לפיזור ולפלורסנציה
האופטיקה, אשר אוספת ומנתבת את האור
הגלאים, אשר קולטים את האור
והאלקטרוניקה והמחשוב ההיקפי, אשר הופכות את האותות
מהגלאים למידע דיגיטלי, ומבצעות את ניתוח הנתונים
נקודת הבדיקה היא לב המערכת
כאן הלייזר והדגימה נפגשות
והאופטיקה אוספת את פיזור האור והפלורסנציה
ראשית, בואו נדבר על איך הדוגמא מגיעה ללייזר
כאן אנו רואים כיצד הדוגמא מובלת אל נקודת הבדיקה
לאיסוף מידע מדוייק, חשוב שהחלקיקים יעברו באלומת הלייזר
אחד אחרי השני
רוב הציטומטרים מצליחים לעשות זאת
על ידי הזרקת הדוגמא לזרם של תמיסה מתאימה
כפי שאתם רואים הזרם הדוגמא נדחס
לבערך תא אחד בקוטר
זה נקרא מיקוד הידרודינמי
למעשה, ציטומטרים יכולים להתמודד עם תאים בהבדלים של כ 3 סדרי גודל
ברוב המקרים, ציטומטרים יזהו תאים בקוטר בין 1 ל 15 מיקרון
למרות שלשימוש במערכות מיוחדות, ניתן לזהות חלקיקים מחוץ לטווח הזה
כעת נראה כיצד משתמשים בלייזר לזהות תאים בודדים בזרם
כאשר התא עובר בלייזר
הוא יחזיר או יפזר את האור בכל הכיוונים
פיזור קדמי או פיזור בזווית קטנה
הוא כמות האור שמתפזר קדימה
כאשר אלומת הלייזר פוגעת בתא
סדר גודל של הפיזור הקדמי שווה יחס בערך לגודל התא
ומידע זה יכול לשמש לכימות את המאפיין הזה
?אך, איך נוכל למדוד את פיזור האור
האור נמדד בגלאי הממיר עוצמת אור למתח
ברוב הציטומטרים, מוט חוסם הנקרא מוט ערפול
מונח מול גלאי הפיזור הקדמי
מוט הערפול מונע מאלומת הלייזר החזקה מלהגיע לגלאי
כאשר תא חוצה את הלייזר האור מתפזר סביב מוט הערפול
ונאסף על ידי הגלאי
האור המפוזר שנקלט בגלאי מתורגם לפעימת מתח
משום שתאים קטנים מייצרים פחות פיזור אור
ותאים גדולים מייצרים יותר פיזור אור
סדר גודל פעימת המתח עבור כל תא
פרופורציונלית לגודל התא
אם נצייר היסטוגרמה של הנתונים
תאים קטנים יופיעו משמאל, וגדולים מימין
היסטוגרמה של פיזור קדמי
היא תצורה גראפית של ההתפלגות בתוך האוכלוסיה
אך גרף כזה מייצג מידע חד מימדי
כעת, בואו נתבונן בפיזור צידי
כפי שראינו, תא שנע דרך אלומת הלייזר
יפזר אור בכל הזוויות
פיזור אור בזוויות גדולות יותר
למשל הצידה
נגרם על ידי גרגור ומורכבות מבנית בתוך התא
האור המפוזר הזה ממוקד דרך מערכת עדשות
ונאסף על ידי גלאי נפרד
לרוב ממוקם ב90 מעלות ממסלול הלייזר
האותו הנאספים על ידי הגלאי ניתנים להצגה על היסטוגרמה חד מימדית
כפי שראינו עבור פיזור קדמי
ההיסטוגרמות החד מימדיות שראינו עד כה
לא בהכרח מראות את מורכבות אוכלוסיית התאים
למשל, מה שנראה שאוכלוסייה יחידה בהיסטוגרמת הפיזור הקדמי
היא במציאות מספר אוכלוסיות
שניתן לזהותם רק בהתבוננות במימד השני
זה נעשה על ידי שימוש בגרפים דו מימדיים של נקודות
ניתן לראות שנקודות השיא בהיסטוגרמות
מתאימים לנקודות הצבועות בגרף הפיזור
כעת נוכל לראות את התוצאות שהתקבלו
כאשר יוצרים גרף פיזור בעזרת נתוני פיזור קדמי וצדדי
מבדיקת דם רגילה
האוכלוסיות שעולות כוללות תאי דם לבנים
אשר הינם תאים קטנים עם מעט מורכבות פנימית
מונוציטים , תאים בינוניים עם מורכבות בינונית
ונוטרופילים וגרנולוציטים אחרים
שהינם תאים גדולים עם מורכבות פנימית גבוהה
בדיקה רבת הפרמטרים הזאת
היא הכח האמיתי של ציטומטריה
כעת נתבונן במאפיין נוסף שיוכל ללמד אותנו עוד
על מבנה ותפקוד התא
פלורסנציה
בקצרה, פלורסנציה היא מונח המתאר את עירור הפלורופור
לרמה אנרגיתית גבוהה יותר
ולאחריה ירידה של הפלורופור לרמת הבסיס תוך פליטת אור
האנרגיה באור הנפלט, תלוי באנרגיה בה מעורר הפלורופור
ולאור זה יש אורך גל מסויים ומכאן שגם צבע מסויים
אחת מהדרכים הנפוצות ביותר לחקור מאפיינים תאיים
בעזרת ציטומטריה, מערבת שימוש במולקולות פלורסנטיות
כמו נוגדנים מסומנים בפלורופור
בניסויים אלו, הנוגדן המסומן מצורף לתמיסת התאים
הנוגדן נקשר למולקולה ספציפית על פני התא או בתוכו
לבסוף, כאשר אלומת לייזר באורך הגל המתאים
פוגעת בפלורופור, אות פלורסנטי משוחרר
ונקלט בידי גלאי הציטומטר
?כיצד מידע הפלורסנציה נתקבל
האור הפלורסנטי המגיע מתאים מסומנים, העוברים דרך הלייזר
נע באותו מסלול כמו הפיזור הצדדי
כאשר האור נע לאורך המסלול
הוא מנותב בידי סדרת מסננים ומראות
כך שטווחי אורכי גל מסויימים, יגיעו לגלאים הנכונים
נתוני הפלורסנציה נאספים באותו האופן כמו פיזור קדמי וצידי
באוכלוסיית תאים מסומנים, חלק יהיו זוהרים יותר מאחרים
כשכל תא חוצה את מסלול הלייזר
אות פלורסנטי נוצר
האור הפלורסנטי מנותב לגלאי המתאים
שם הוא מתורגם לפעימת מתח
פרופורציונלית לפלורסנציה שנפלטה
כל פעימות המתח נמדדות ויכולות להיות מוצגות גראפית
?מה עם נרצה לערוך ניסוי בשני צבעים
נצטרך להתבונן בטווחים של שני הפלורופורים לראות אם הם מתאימים
R-PE אלקסה פלור 488 ופיטואריתנין
בהם משתמשים לרוב ביחד
עבור שני הפלורופורים הללו, האור היעיל ביותר לעירור הוא 488 ננומטר
כאשר הם מעוררים באור זה
ניתן לראות ששיאי הפליטה שלהם מספיק רחוקים
כך שנתונים עבור כל אחד יוכלו להאסף במקביל
צבעים מתאימים כמו אלו
מאפשרים למדענים להשתמש בשני צבעים באותו הלייזר
אם נשתמש במידע משני הניסויים הללו בעזרת גרף פיזור
ארבע אוכלוסיות יעלו
אם נחלק את גרף הפיזור לרבעים נראה
שתאים בעלי פלורסנציה כתומה בלבד יופיעו ברביע השמאלי העליון
תאים בעלי פלורסנציה ירוקה בלבד יופיעו ברביע התחתון הימני
תאים בעלי פלורסנציה ירוקה וכתומה גבוהות יופיעו ברביע הימני העליון
ולבסוף תאים בעלי פלורסנציה כתומה וירוקה חלשות יופיעו ברביע השמאלי התחתון
מאפיינים בעלי מספר צבעים נחוצים לניתוח מערכות ביולוגיות מורכבות
RPE כיצד הציטומטר אוסף מידע נפרד מאלקסה פלור 488 ו
קיימים מסננים שמסוגלים לתפוס את נקודת השיא
מכל אחת מהמולקולות הללו
מסנן 530 ננומטר יאסוף את רוב פלורנצית השיא של אלקסה פלור 488
ומסנן 585 יאסוף את רוב פלורסנצית השיא
RPE של
על ידי שימוש במסננים אלו,פרופורצית הכמות של פלורסנצית שני הפלורופורים
ניתן להקליט את הפלורסנציה של כל תא
ניתן לראות שחלקים של כל אחת משיאי הפליטה חופפת עם השניה
זה נקרא חפיפה ספקטראלית
ונדבר על כיצד מתמודדים איתה בסרטון אחר
בואו נדבר רגע על מינוח מסננים
מסננים מוגדרים לרוב על ידי אחד משני פרמטרים
נקודת המרכז למסנן חוסם פס
או הקצה של מסנן מעביר גבוהים או נמוכים
RPE זה מסנן חוסם פס טיפוסי שמתאים ל
יש לו נקודת אמצע של 585 ננומטר
ורוחב של 42 ננומטר
כך שהמסנן הזה מעביר אור באורכי הגל 584-686 ננומטר
PE שמתאימים לשיא הפליטה של
מסננים נוספים שמשמשים להעביר את השיא הזה הם
מסנן מעביר גבוהים של 550 ננומטר
ומסנן מעביר נמוכים של 610 ננומטר
נקדה חשובה אחרונה לגבי איסוף המידע
הוא השימוש בגבול
אם כל חלקיק שעובר דרך אלומת הלייזר
יגרום למכשיר לאסוף מידע
מאגר המידע יתמלא במידע שיגיע ממספר גדול של חלקיקים קטנטנים
כמו טסיות דם ושברי תאים
על מנת למנוע את זה, נקבע קו גבול
כזה שצריך להגיע לגודל פיזור אור קדמי מסויים
על מנת שהמכשיר ימדוד אותו
בהיסטוגרמה, האזור הבהיר מייצג את התאים הקטנים ושברי התאים
אשר מוצאים מניתוח הנתונים על ידי הגבול
זה אומר שרוב הארועים שהציטומטר מודד
יהיו התאים הנבדקים
זה חשוב להבין שהתאים הקטנים העוברים דרך המכשיר
אינם נמדדים
הגענו לסוף הסרטון
מסעינו החל במבט על המערכות המרכיבות את הציטומטר
וכיצד הן פועלות יחדיו לאסוף מידע מהתאים
כאשר הם עוברים דרך אלומת הלייזר
המשכנו בהתבוננות יותר מעמיקה
כיצד הציטומטר מזהה פיזור אור ופלורסנציה
וכיצד ניתן להתבונן במידע זה בגרפים שונים
בקיצור, ציטומטריה היא שיטה ייחודית
המאפשרת למדענים לאסוף מידע סטטיסטי
על מספר גדולים של תאים
ולהשתמש במידע הזה להתאים פרמטרים רבים בתוך אוכלוסית התאים
ניסויים של 4-6 צבעים הופכים לקלים יותר
מעבדות ספורות בעולם יכולות להבדיל בין 18 צבעים בו זמנית
בסרטון הבא נדון בפירוט בהיבטים המורכבים יותר של ניתוח נתונים
אשר משמשות בציטומטריה
בייחוד אם נעשה שימוש בשני צבעים או יותר
סרטון זה תורגם בידי צוות אתר דווידסון אוליין
לסרטונים נוספים הכנסו לאתר דווידסון אונליין - מאגר מדע
www.weizmann.ac.il/ davidson/maagarmada